Con aproximadamente 15 años dirigió cortometrajes varios, de los que únicamente se ha editado uno: Relatos de la media noche, muestra de lo que sería su futuro como actor y director. Tras acabar los estudios básicos, estudió la carrera que pensó que se le iba a dar mejor: Bellas Artes, pues desde su juventud tuvo una gran habilidad para el dibujo.
Segura es un gran aficionado al mundo del comic y un excelente dibujante, tras sus coqueteos en el comic estreno su primer corto "Evilio" con el dinero que habia recaudado en su aparaicion de multitud de concursos de television de la epoca. Perturbado gano el Goya a mejor cortometraje de la epoca y le sirvio para darse a conocer al circulo de directores famosos españoles. A perturbado seguria cortos como Evilio el purificador . Segura es un reconocido seguidor del director Luis Garcia Berlanga y jesus Franco, Gracias a su inegable don de gentes Segura consiguio papeles en el film de Berlanga Todos a la Carcel y Killer Barbies del Jess Franco. Pronto se converteria en el actor fetiche del guru del cine fantastico i de terror español Alex de la Iglesia, como veriamos en Accion Mutante, El dia de la Bestia, Perdita Durango o Muertos de Risa
Terminó la carrera y se dedicó por completo al cine. En 1989 dirigió el que sería su último cortometraje en Súper-8: el ya citado Relatos de la media noche. Dos años más tarde, conoció al director que más trabajo le ha dado hasta la fecha: Álex de la Iglesia, quien tras conocer a Segura en un festival de cortometrajes de Valencia lo fichó para la primera película en común: Acción Mutante (1992).
Al mismo tiempo, Segura empezó a sacar partido al haberse recorrido los despachos de productores de toda su zona y alrededores, apareciendo en películas con papeles pequeños (Two Much, Todo es mentira, etc.). Mientras seguía con su carrera como cineasta, dirigió Evilio (1992) con el dinero conseguido tras participar en múltiples concursos de televisión. Dos años más tarde conseguiría su primera gloria al obtener el Goya al mejor cortometraje por Perturbado (1993).
Siguió en su línea de papeles pequeños y medianos hasta que otra vez Álex de la Iglesia le dio la oportunidad de hacer de secundario en El día de la Bestia, donde hacía de José Mari —dependiente de una tienda de música heavy, obsesionado con el satanismo y miembro de una familia de clase obrera—, papel por el que obtuvo el Goya de mejor actor revelación en 1996.
A partir de este momento, fue cobrando poco a poco más protagonismo hasta conseguir la fama absoluta con su propio largometraje Torrente: El brazo tonto de la ley, película que le llevó a alcanzar bastantes objetivos, como eran: trabajar con Tony Leblanc, hacer la película española "más vista" y taquillera hasta entonces o conseguir el Goya al mejor director de 1999. Alcanzado este punto, su fama era ya innegable: Segura había creado un símbolo, Torrente, que tiene incluso una figura en el museo de cera. Es este un personaje plagado de influencias y referencias, desde Paco M. Soria y sus películas como protagonista, hasta personjes populares como el Tte. Coronel Antonio Tejero.
Tras darle un papel en Perdita Durango, De la Iglesia lo ficha por última vez, hasta el momento, para darle un papel co-protagonista con el Gran Wyoming en Muertos de risa, película en la que encarnaba a un cómico que termina a tiros con su pareja humorística. Fue durante el rodaje de este film donde conoció a Rosanna Walls, la que sería la mala de Torrente 2: Misión en Marbella.
Este segundo largometraje dispuso del doble de presupuesto que el primero y en él contó también con un reparto de lujo. Por esta película no obtuvo ningún galardón, pero consiguió llevar al cine a 5.500.000 espectadores. Después de Torrente 2, Segura ha obtenido cada vez más protagonismo en el panorama cinematográfico nacional e internacional, y ha conseguido sumirse mínimamente en el cine de Hollywood con pequeños papeles en Blade 2 o Hellboy, ambas películas dirigidas por su también amigo Guillermo del Toro.
Santiago Segura tiene el récord de nominaciones en la historia de los Premios Godoy (Una parodia de los Premios Goya en donde se premian las peores películas españolas del año), 11, a la vez que durante dos años consecutivos (2003 y 2004) consiguió estar nominado tanto en las categorías de actor principal y de reparto. En 2005 también consiguió nominación.
En su trilogia de Torrente ha sido un escaparete para la mayoria de personajes publicos de la cultura española, ademas de contar de cameos de directores como Oliver Stone, John Landis o Guillermo del Toro
En los últimos años, como actor, ha protagonizado películas como El oro de Moscú, Una de zombis, Isi Disi o El asombroso mundo de Borjamari y Pocholo y, como productor, ha realizado Una de Zombis, Asesino en serio y Promedio Rojo, entre otras.
El 30 de septiembre de 2005 se estrenó en toda España la tercera parte de la famosa saga de Torrente: Torrente 3: El protector.
En el mundo del cómic es conocida su faceta de coleccionista de originales. Forman parte de su tebeoteca originales de Bernie Wrigtson, Richard Corben, Frank Frazetta, Sanjulian, Robert Crumb, Alex Raymond y Hal Foster entre otros.
En abril de 2007 se estrenó como presentador de televisión, con el programa Sabías a lo que venías, de La Sexta